植物的表型性状是育种家、植物科学家和栽培人员最关心的指标之一，也是最耗费劳动力的指标。植物表型性状可以分为三大类：形态结构性状、生理功能性状和组分含量性状(韩志国，2019)。

 

 

形态结构性状，是大部分提到表型首先想到的内容。看得见、摸得着，可以利用人工智能算法加持进行分析。组分含量性状，传统的实验室都可测量，目前也逐渐出现利用光谱感测技术在田间测量的趋势。而生理功能性状，也就是植物的“喜怒哀乐”，往往(在早期)看不见也摸不着，等到肉眼能看出来的时候，往往已经进入“病入膏肓”的阶段了。

 

现有的高通量表型技术，如可见光成像、三维激光、激光雷达等，主要聚焦于形态结构性状的测量;如多光谱成像、高光谱成像等，可以通过指数来间接反映组分含量性状或粗略反映生理功能性状;而生理功能性状的测量难度最大，对传感器的要求最高。在育种三大目标“产量、品质、抗性”中，抗性(生物胁迫或非生物胁迫)是特别重要的，是保障稳产的核心生产力。生理功能的变化能早期(在肉眼可见之前)反映各种胁迫的程度，甚至生理变化亦可以作为胁迫定量评估的探针。

 

对于生理功能性状而言，又可以分为两类：浅层生理功能性状和深层生理功能性状。

 

一类是以各种多光谱或高光谱产生的植被指数，以及热成像测量的植物冠层温度，由于都属于生理过程的外在表现，可以称之为“浅层生理功能性状”。有些植被指数非常容易理解，算法也简单，在育种上也有较好的相关性，因此利用多光谱技术(比较便宜!)进行测量用于育种，在国际上还是非常多的，国内这几年也陆续开始使用。

 

　　

另一类我称之为“深层生理功能性状”，主要是以测量冠层尺度光合作用活性相关的技术为主。光合作用的重要性大家都清楚，我想强调的是，由于光合作用是植物体内最重要的化学反应，且和上下游各生理代谢密切偶联，因此光合作用本身就是一种探针。以光合作用为代表的“深层生理功能性状”，除了能反映植物的光合作用效率(光能转变成化学能的效率)、光合作用速率(电子传递速率、碳同化速率)，还能够通过测量植物将过剩的(事实上，光能对植物永远是过剩的)有可能产生自由基的(会造成不可逆伤害)光能转化为热耗散到环境中去的能力——也就是光保护能力。这些指标在各种有关非生物胁迫(旱、涝、冷、热、盐、化学品等等)和生物胁迫(病、虫等)的研究中，是最容易测量也最广泛使用的技术。

 

 

此外，大家往往都说“光合作用很重要”，但“找不到光合作用和产量的关系”。导致这种情况的一个重要因素是过去对光合作用的测量往往停留在叶片尺度，而植物有很多叶片，每个叶片乃至叶片的不同部位测量的光合作用结果都不一致，这样“一片田选取三株植物、一株植物选取三个叶片”的测量方式，即使每个数据都无比精准，但对“这片田”的代表性却不高，这可能也是“找不到光合作用和产量的关系”的一个原因。

 

现阶段能够在田间快速、无损乃至原位测量植物生理功能的表型技术，主要是光合表型技术，其中最主流的是叶绿素荧光技术。早期主要是光纤型的荧光仪，能够测量叶片上直径1cm内的一个点。随着LED和CCD技术的发展，叶绿素荧光成像技术(成像面积从18x18cm、50x50cm到100x100cm，甚至更大)快速普及，突破了光纤型技术“管中窥豹”的缺点，基本实现了在冠层尺度上对生理功能进行准确、早期、定量评估。

 

我们知道，万物皆可发荧光。植物的叶绿素在接受激发光后也可以发出荧光，叫做叶绿素荧光。常规物质发出的荧光强度依赖于激发光的强度，在相同的激发光照射下，荧光强度不变。而叶绿素荧光有意思的地方在于，在激发光照射下，荧光强度有一个持续时间达几分钟(甚至十几分钟)的动态变化，这个动态变化过程和光合作用密切相关。

 

 

由于常温常压下叶绿素荧光主要来源于光系统II的叶绿素a，而光系统II处于整个光合作用过程的最上游，因此包括光反应和暗反应在内的多数光合过程的变化都会反馈给光系统II，进而引起叶绿素a荧光的变化，也就是说几乎所有光合作用过程的变化都可通过叶绿素荧光反映出来。与其它测量方法相比，叶绿素荧光技术还具有活体测量、简便、快捷、可靠等特性，因此在国际上得到了广泛的应用。

　　

自从1931年Kautsky将叶绿素荧光与光合作用关联起来后，在长达80多年的时间里，叶绿素荧光成为高等植物和微藻生理生态测量的主要技术之一，在世界范围内得到了广泛应用。

 

 

直到进入21世纪第二个十年，随着人们对于植物表型和表型组学的认识逐渐深入，研究人员开始接受“生理活性也是植物表型指标”的观点。此时，叶绿素荧光测量系统也已由“点测量”(光纤型荧光仪)发展到“面测量”(叶绿素荧光成像测量)时代。

 

 

实际上，从21世纪初开始，一些叶绿素荧光成像领域的顶级科学家已经敏锐的认识到叶绿素荧光成像系统的强大应用潜力。例如瓦赫宁根大学的高级研究员Henk Jalink博士，在2002年就设计出搭载在多轴机械臂上能测量整个冠层叶绿素荧光成像的自动化系统，这是目前所知最早将叶绿素荧光成像用于高通量测量的案例之一。

　　

此后，Jalink博士又将可见光成像、多光谱成像、GFP/RFP成像等技术和叶绿素荧光成像无缝对接，实现了一个CCD完成上述所有测量，从而达到了像素尺度的高精度参数反演，可以在最大2mx 2m的范围内获取可见光表型、光合生理、色素浓度、NDVI等指标。此时的叶绿素荧光成像系统已经不仅仅是叶绿素荧光成像仪，而发展成为功能强大的光合表型成像测量系统。

　　

叶绿素荧光和光合作用关联的原理非常复杂，简言之，根据能量守恒定律，植物吸收的能量(1)=光合作用(P)+ 叶绿素荧光(F)+ 热量耗散(D)。P、F和D呈此消彼长的关系。叶绿素荧光强度可以通过测量出来，我们希望知道光合作用和热耗散分别是多少。一个等式有两个未知数，无解!此时巧妙的事情出现了，可以通过仪器给出一个瞬间(<0.8s)的强光，让光合作用暂时变为零，由此得出热耗散，进而得出光合作用。一个无解的僵局被外来的一束光给打破了。有意思的是，这束光关闭后，光合作用会迅速恢复正常，植物生长不受影响。更有意思的是，这个热耗散，专业名称叫做非光化学淬灭NPQ，反映的是植物将过剩的光能耗散到环境中变成热量而不是产生自由基的能力，也就是说，在逆境条件下，NPQ越强，植物的抗逆性越强。

　　

 

叶绿素荧光技术是测量光合生理的，其中最重要的参数是Fv/Fm，也就是最大光合效率。早在1987年，国际光合作用领域的顶级大咖Olle Björkman教授和他的博后Barbara Demmig(现在也是顶级大咖了)就首次提出高等植物在健康的生理状态下，最大光合效率Fv/Fm在0.83-0.84左右，Fv/Fm下降即是生理受到了胁迫的观点。整整35过去了，这个观点被证明是正确的，且得到了大范围应用!将叶绿素荧光成像和可见光成像、多光谱成像叠加在一块并用一个CCD来检测，就形成了近些年非常流行的光合表型成像技术。

 

当然，和光合表型成像相关的参数有数十个，这里就不一一介绍了。这种技术由于具有“Exploring beyond visible”的强大特性，而得到了广泛应用(需要指出的是，在笔者查到的最早的1990年的文献上，就是由日本的农化公司首先提出叶绿素荧光成像测量的)，下面举几个例子。

 

案例1，盐胁迫

对盐胁迫敏感株而言，即使处理到13天，肉眼仍未见显著差异，而叶绿素荧光成像可以看出光合作用已经受到抑制。

 

　　

案例2，高低温胁迫

下面两图可以看出，冷害往往首先作用于娇嫩的生长点，而热胁迫往往首先作用于叶片边缘，传统的生理测量往往只测量叶片中部，难以从全局角度看出问题。

 

 

案例3，干旱胁迫

有人曾推测，全球70%的非生物胁迫论文是关于干旱胁迫。笔者大胆推测，可能全球60-70%的和干旱胁迫相关的论文，用到了Fv/Fm这个指标。各位老师可以在后面阅读相关文献时留意一下是否如此。

 

　

案例4，病虫害胁迫

蓟马是甜椒的主要害虫之一，对其危害程度的量化评估是抗性品种筛选的关键指标之一。本例中，经过和育种家沟通后，认为将Fv/Fm < 0.5的区域，可以判定为这个抗虫实验中的虫害区域，进一步可以快速计算出该区域的面积大小，从而实现了在冠层尺度对虫害的精准评估，大大加速了抗虫甜椒的育种过程。

 

 

案例5，除草剂的作用

除草剂可以作用于代谢路径(多数是电子传递链)的特点位点，阻断特定生理过程从而达到杀死植物的目的。很多植物在吸收除草剂后，生理阻断了，但叶绿素还未分解，因此尽管已经受到“内伤”，但“外观”还是好的。传统的表型难以测量出这种现象，而叶绿素荧光成像这种生理表型技术可以完美的解决这一点。

 

　　

笔者想强调的一点是，这种技术已经可以测量冠层，已经可以走到温室、走到田间，甚至可以进行高通量测量了。举两个例子：

 

1)低通量人工辅助测量

我们与光合表型成像技术最顶尖的公司荷兰PhenoVation合作，将传统的室内测量传感器集成到性价比非常高的田间测量车上，可以根据样品(叶片、果穗、果实等)的位置和朝向进行灵活测量，已经在麦穗、稻穗等的测量中得到成功应用。

 

 

2)高通量自动测量

我们将成像面积 > 50x50cm的光合表型成像仪集成到三轴自动化测量平台上，实现在数百乃至上千平米的区域全自动高通量“光合生理+可见光表型+植被指数+色素含量”测量。该技术已在国内得到成功应用。

 

 

笔者认为，生理表型测量的核心在于“早、快”，要在肉眼可见之前就能测量并预判出变化趋势，才是这个技术的核心价值。叶绿素荧光成像，恰好满足了这个要求。我们江南平台app体育公司，也希望在这个领域能做更多的工作，和可见光表型、光谱表型一块，用植物表型技术加速育种，用植物表型技术助力智慧农业。